最终诊断

    
    【最近在忙新书，还有本职工作，所以修改会慢一点，大家可以等完本再看】
    放疗(RT)是肺癌必不可少的治疗方式。对于不适合手术的IIIA 和 IIIB 期肺癌患者，根治性放化疗是治疗标准，这一点已被广泛接受。不幸的是，放疗后肿瘤的再生长是成功控制疾病的主要障碍。
    临床前研究表明，放疗对原发部位和转移部位的肿瘤免疫微环境具有双重作用。一方面，局部照射有可能激活针对远离照射区域的肿瘤细胞的全身免疫反应，即远隔效应，由Mole 在 1953 年首次报道。RT促进肿瘤抗原从垂死的肿瘤细胞中释放，上调MHC I 类表达，并增加多种细胞因子和免疫效应分子的表达，包括白细胞介素(IL)-1、细胞间粘附分子 1 (ICAM1)和血管细胞粘附分子1 (VCAM1)，所有这些都有助于由辐射引发的持久和全身抗肿瘤免疫。另一方面，放疗促进了肿瘤细胞的免疫逃避。例如，RT上调多种免疫抑制细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-10 和转化生长因子-β(TGF-β)。RT 促进免疫抑制细胞的积累，例如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、调节性T (Treg)细胞和髓源性抑制细胞(MDSC)。辐射增强免疫检查点的活性，如程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)/PD-L1、细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白4 ()、T 细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域的蛋白3 (TIM3)，和淋巴细胞激活基因3 (LAG3)。
    为了克服放疗的免疫抑制作用，已经提出并测试了免疫疗法和放疗的各种组合。在 PACIFIC 研究中，标准放化疗后加入durvalumab可延长III 期 NSCLC 患者的无进展生存期和总生存期。PACIFIC 研究的巨大成功不仅改变了III 期非小细胞肺癌的临床指南，也引起了其他免疫疗法与RT 结合的极大兴趣。
    MDSCs的积累和激活在免疫抑制的建立中起关键作用。RT 对 MDSCs 的确切影响是复杂的。大分割照射(20 Gy)抑制 MDSCs 的积累和浸润，而较低剂量的照射往往会促进 MDSCs 募集到肿瘤中。此外，临床前和临床研究表明，胃肠道肿瘤，包括结直肠癌和肝癌，在放疗后相对容易出现MDSCs 水平降低，而在其他肿瘤模型和临床环境中，如胶质瘤、肺癌、乳腺癌、头颈部鳞癌、前列腺癌和宫颈癌，导致MDSC 数量持续增加。蔡等人首次报道 MDSCs的 PD-L1 表达被辐照上调。然而，关于MDSCs 的确切作用，尤其是其潜在机制，在辐照后塑造TME 方面知之甚少。
    MDSCs是一组具有强大免疫抑制能力的异质髓细胞。根据表型和形态，MDSCs又可分为多形核MDSCs(PMN-MDSCs，又称粒细胞型MDSCs)和单核型MDSCs(M-MDSCs)。
    免疫抑制活性是MDSCs的关键标志。MDSCs的抑制机制包括诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(ARG1)和吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)的表达，以及一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的产生。这些不同的机制不会同时起作用。人们普遍认为PMN-MDSCs和M-MDSCs通过不同的机制调控TME。此外，PD-L1的上调也被认为是辐射招募MDSCs的免疫抑制机制之一。目前，对于辐照诱导的MDSCs对TME的影响及放疗的治疗效果尚无一致的结论。
    磷酸二酯酶-5(PDE5)抑制剂，如西地那非和他达拉非，可以阻断环磷酸鸟苷(cGMP)的水解。最新数据表明，PDE5 抑制剂能够通过抑制荷瘤(TB)小鼠和患者MDSC 中iNOS 和 ARG1的活性和表达来促进抗肿瘤免疫。然而，PDE5 抑制剂如何影响MDSC 的亚群以及RT 和 PDE5 抑制剂的组合是否会延迟辐射后的肿瘤再生尚未得到测试。
    我们最近的研究表明，消除招募的MDSC 会延迟放疗后路易斯肺癌(LLC)的再生。在这里，我们报告了局部照射通过促进PMN-MDSC 的增殖及其随后向TME 的募集而削弱了抗肿瘤免疫力。ARG1的上调和激活是照射后PMN-MDSCs介导的T细胞抑制的主要机制。西地那非与放疗的组合通过抑制 ARG1 过表达和 PMN-MDSC 募集消除了辐射衍生的免疫抑制。
    在TB 小鼠和癌症患者中，MDSCs随着肿瘤的生长而扩增。MDSCs 的两个亚群之间的比例取决于特定的肿瘤模型和微环境。为了监测同源LLC 模型中MDSC 的丰度，我们通过免疫表型分析确定了接种后肿瘤的生长以及LLC 小鼠中不同时间点的总体MDSC 及其亚群。
    如图1C所示，肿瘤组织中总MDSCs的百分比随着肿瘤的发展而稳步增加，从接种后第一周肿瘤浸润淋巴细胞的不到10%（5.84±1.22%）上升到第四周超过20%（21.71± 3.22%）（P<0.01）。在我们的LLC 模型中，PMN-MDSCs占总MDSCs 的 94.94 ±8.47%，并且与总MDSCs 具有相同的肿瘤发展趋势（P < 0.05）。对亚群进行分析，虽然M-MDSCs 增加了大约5 倍，但差异没有统计学意义。
    为了更好地了解MDSCs 的全身分布，我们还研究了MDSCs 在外周血、脾脏和骨髓中的比例。仅在接种LLC细胞一周后，TB小鼠外周血中的MDSC百分比是无瘤小鼠的两倍(27.33±4.62%vs. 12.48±0.93%， P<0.05)， 3周后的MDSC百分比是无瘤小鼠的5倍(27.33±4.62% vs. 12.48±0.93%，P<0.05)。TB小鼠外周血中PMN-MDSCs的比例也增加，而M-MDSCs的比例与肿瘤大小无关。
    PD-L1 是肿瘤细胞、MDSCs、巨噬细胞和树突状细胞表达的最重要的检查点分子之一。为了确定TB 小鼠MDSCs 的 PD-L1 表达是否与健康小鼠不同，我们通过流式细胞术测试了MDSCs 的 PD-L1 表达。结果表明，TME中MDSCs上PD-L1的平均荧光强度（MFI）从在 LLC 细胞接种后的第一周386.8± 100.9 逐渐增加到第四周的1，068.0 ±121.8 （ P <0.01），这表明PD-L1 在我们模型中的MDSC 中具有潜在作用。
    在脾脏和骨髓中，随着肿瘤的发展，MDSCs的比例也显著增加，其模式与肿瘤组织和外周血中的MDSCs相同。此外，我们在TB小鼠中观察到明显的脾肿大，这与我们观察到的MDSCs在脾内聚集一致。
    为了确定局部照射对肿瘤生长和MDSCs的影响，当肿瘤直径达到7.5 mm时，我们使用大分割RT(20 Gy/F)治疗皮下LLC肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为500mm 3，但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精-伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的CD11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是CD11b+髓系细胞，这表明局部照射可能导致MDSCs的积累。为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总MDSCs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后，放疗后肿瘤浸润MDSCs的比例比未治疗肿瘤高2倍(ctrlvs. RT=21.33±3.29% vs. 44.10±3.00%，P<0.001)。PMN-MDSCs与总MDSCs具有相同的增加趋势(ctrlvs. RT=16.37±2.47% vs. 38.66±4.24%，P<0.001)，而M-MDSC比例保持在约0.1%，且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。
    为了确定受照射肿瘤中PMN-MDSC 的逐渐积累是否有助于LLC 肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗Ly-6G 单克隆抗体来消耗MDSC .抗Ly-6G抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中PMN-MDSC的频率（P<0.05）。此外，用抗 Ly-6G 抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明PMN-MDSC的募集对肿瘤再生至关重要。
    虽然PMN-MDSCs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对CD8+T细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定RT 后 PMN-MDSCs 诱导的免疫抑制是否依赖于CD8 + T 细胞，我们通过流式细胞术评估了CD8 + T 细胞的数量和功能。
    如图3D 所示，CD8 + T 细胞的百分比随着照射从11.71± 2.31%下降到2.42 ±0.62%(P<0.01)。PMN-MDSC耗竭逆转了这种下降（ RT + anti-Ly-6G 抗体= 2.42 ±0.62% vs. 20.12 ±3.92%，P<0.01）。为了更好地了解CD8 + T 细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了CD8+ T 细胞内部和表面上IFN-γ、CD28 和 PD-1 的表达。局部 RT 显着降低了 CD8 +T 细胞分泌 IFN-γ的比例，从33.06 4.53%降至13.25 2.08%，并增加了表达 PD-1 的 CD8 + T 细胞的比例（ctrlvs. RT=253.20± 57.03 au vs. 538.80 ±98.76） au，P<0.05）。
    CD28 表达未观察到显着变化。当抗Ly-6G抗体被给予辐照小鼠时，IFN-γ分泌达到与未处理的 LLC 小鼠相同的水平（29.74±3.55%），而与辐照小鼠进行比较抗Ly-6G抗体处理后的PD-1 表达没有变化小鼠。因此，在这部分我们建议PMN-MDSCs 通过抑制CD8 + T 细胞促进放疗后肿瘤的再生。PMN-MDSCs 不仅抑制了TME 中 CD8 + T 细胞的数量，而且还抑制了其活性。
    为了确定辐照诱导MDSCs的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及iNOS和ARG1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部RT增强了ARG1的表达，但没有增强iNOS的表达。ARG1活性测定表明，局部照射显著提高了ARG1的活性，从0.400.15 U/L提高到3.78 0.39 U/L ((P<0.01)。相比之下，NO荧光标记的iNOS活性检测显示，辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。
    PD-L1的表达是MDSCs 的一种新型免疫抑制机制。然后我们询问PD-L1 上调是否是RT 后 MDSCs 介导的免疫抑制的机制之一。通过流式细胞术分析辐照后MDSC 中 PD-L1 的表达。图4E 显示，与未处理组相比，受照射肿瘤的MDSC 中的PD-L1 表达在照射后不久显着增加（照射后第三天：ctrlvs. RT=443.9 ±175.3 au vs. 1328.0 ±324.3 au，P<0.05）.然而，此后PD-L1表达继续下降，局部照射组在照射后第3周显着低于未治疗组（ctrl vs. RT=1，465.0± 399.6 au vs. 407.5±164.8 au，P<0.05）。外周血中MDSCs 的 PD-L1 表达与局部肿瘤部位的表达趋势相同。
    以上数据表明ARG1表达的上调是照射后PMN-MDSCs抑制功能的合理机制。然而，不涉及 PD-L1 和 iNOS的调节。为了进一步证实这一假设，在辐射后通过灌胃给予ARG1 抑制剂nor-NOHA。10 mg/kg/d nor-NOHA 有效地将ARG1 活性从3.78 0.39 U/L 降低到2.02 0.25 U/L（P<0.01）。
    RT后给予nor-NOHA显着增加CD8+T细胞比例（RT vs. RT+nor-NOHA=2.420.62% vs. 6.14 0.64， P<0.01），并伴有肿瘤再生延迟。iNOS抑制剂1400W 对肿瘤再生长没有影响。
    我们的结果表明，RT通过上调肿瘤内PMN-MDSC 的百分比和ARG1 活性来促进肿瘤免疫逃避。推测抑制PMN-MDSCs 及其ARG1 活性可能是一种新的抗肿瘤策略是合理的。越来越多的证据表明，PDE5 抑制剂可以抑制TB 小鼠和癌症患者MDSC 中 iNOS和 ARG1 的活性和表达。因此，通过灌胃给予西地那非20 mg/kg/d，以研究它是否可以促进RT 的抗肿瘤作用并阐明潜在机制。如图5B 所示，正如我们预期的那样，西地那非延迟了照射后的肿瘤再生长，这与阳性对照Nor-NOHA 相当。TME 的免疫特征表明，当给予西地那非时，肿瘤内PMN-MDSC 的比例从38.66±4.24%下降到23.57±2.38%。
    此外，西地那非也显着降低了ARG1 的表达。为了进一步检查西地那非对MDSC 的抑制是否真的导致抗肿瘤免疫增强，我们分析了肿瘤内CD8 + T 细胞的比例和活性。流式细胞术分析表明CD8 + T 细胞的百分比从2.42 ± 0.62%增加到7.21 ± 1.22%。
    此外，当给予西地那非时，CD8 + T 细胞分泌的IFN-γ也显着升高。因此，我们证实PDE5 抑制剂西地那非通过调节PMN-MDSCs 改善了照射后肿瘤免疫微环境。西地那非联合放疗可能是提高放疗疗效的一种有前景的策略。
    工作揭示了PMN-MDSCs中ARG1通路介导RT后肿瘤再生的新机制，如图6所示。我们认为，PMN-MDSCs是辐照招募的主要亚型，而不是M-MDSCs。在广泛的免疫抑制机制中，ARG1的上调和激活是PMN-MDSCs在放疗后抑制CD8+T细胞的主要机制。为了克服PMN-MDSCs引起的免疫抑制，我们提出并证明，sildenafil和RT联合使用降低了PMN-MDSCs在TME内的募集和免疫抑制作用，激活了CD8+ T细胞应答，导致肿瘤生长延迟。综上所述，我们的研究结果为缓解免疫抑制TME以提高RT治疗效果提供了一种新的解决方案。虽然所有这些结果都是在LLC小鼠模型中进行的，但同样的机制是否适用于其他肿瘤模型尚不清楚。此外，在不同的辐射方案下，MDSCs及其亚型如何影响TME仍未确定。因此，这些问题还需要进一步的研究来解决。