最终诊断

    
    ?结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，平均5年总生存率（OS）为60%。原发性 CRC 可通过手术治愈；然而，在转移阶段，OS 显着降低。在转移性结直肠癌（mCRC）中，患者接受治疗性手术或围手术期或姑息性化疗和靶向治疗。
    ?在诊断时，20%–30%的患者患有同步肝转移（LM），所有CRC患者中的50%–75%会发生肝转移，这是导致死亡的主要原因。为了提高OS，我们需要进一步了解 mCRC 并确定其他治疗靶点。虽然临床前研究集中在原发肿瘤（pTU）和转移过程，但临床挑战在于转移患者的最佳治疗。此外，没有常用的免疫活性动物模型重现 CRC pTU 和转移的生长，使得我们对于了解转移性 CRC 充满挑战。
    ?肿瘤细胞在复杂的微环境中生长，涉及驱动肿瘤生长、侵袭和转移的细胞外和细胞内信号。组织力学特性的变化既可以先于疾病发展，也可以推动疾病发展，肿瘤“硬度”与几种肿瘤类型的预后相关。先前的研究表明，包括乳腺癌和胰腺导管腺癌在内的几种实体瘤的疾病进展与其弹性模量相关。
    ?组织刚度是组织抵抗变形的程度，由应力和应变之间的关系描述。在组织水平上，刚度受细胞骨架和细胞外基质（ECM）的控制。纤维状胶原蛋白是最丰富的 ECM 支架蛋白，对组织刚度有显着影响。富含胶原蛋白I（COL-I）的异常 ECM 重构已被确定为癌症进展过程中组织硬化的主要原因。作为 ECM 的主要来源，癌相关成纤维细胞（CAF）通过表达赖氨酰氧化酶（LOX）来进一步改变肿瘤机械环境，赖氨酰氧化酶是一种胺氧化酶，可启动胶原蛋白的共价内和分子间交联过程。在实验模型中，通过 LOX 抑制来抑制基质硬化可改善肿瘤生长并改善治疗。因此，CAF 被认为是限制癌症进展的有希望的治疗靶点。
    ?肿瘤微环境在为肿瘤提供血液供应方面也起着关键作用。通过使用单克隆抗体、VEGF 陷阱或多靶点酪氨酸激酶抑制剂靶向血管内皮生长因子（VEGF）信号通路来抑制 mCRC 血管生成。目前，疗效不足和耐药性限制了抗血管生成疗法的益处。此外，内皮细胞（EC）根据机械环境调节其屏障能力和生长。具体而言，坚硬的基质促进 EC 增殖并可能导致血管完整性缺陷，这表明机械环境可能会影响肿瘤中的 EC 行为，从而影响抗 VEGF 的功效.本研究旨在阐明转移性血管生成是否受机械微环境的影响，机械微环境可以通过 mCRC 中转移相关的成纤维细胞（MAF）激活进行调节，以及是否可以改变这种 MAF 激活以提高抗血管生成治疗的疗效。
    1、CRC中的 MAF 高度激活
    ?在LM中观察到 aSMA、p-MLC2 和 COL-I 的显着更高表达，表明 MAF 的肌成纤维细胞和 ECM 重塑特征。
    ?接下来，从 CRC 患者的 pTU(CAF)和 LM(MAF)中分离出原代成纤维细胞。MAF 显示出 aSMA 和 p-MLC2 的显着上调，证实了肌成纤维细胞和细胞收缩性信号的增加。FAs 的量化显示 MAFs 中 FAs 的平均面积更大（图L和M），支持 CRC MAFs 被高度激活。
    2、晚期 CRC 患者的 ECM 重构和硬化特征
    ?为了鉴定与肝转移相关的基因表达特征，我们对 CRC 患者的 pTU 和 LM 进行了 RNA 测序（RNA-seq）。使用通路相互作用数据库(PID)对 LM中上调基因进行的基因集分析(GSA)揭示了整合素信号传导的显着富集。为了进一步表征成纤维细胞的基因表达，我们在成功富集后对分离的原代 CAF 和 MAF进行了 RNA-seq。
    ?我们鉴定了3，721个差异表达的基因。GO确定了MAF中上调的肌成纤维细胞/ECM重塑特征。KEGG确定了ECM-受体相互作用和FA特征和PID确定了整合素信号（图H）。此外，基因集富集分析(GSEA)还揭示了差异表达基因的肌动蛋白介导的细胞收缩、FA、ECM成分、肌生成和血管生成特征的强烈富集（图I-M）。
    3、MAFs增加微环境硬度，支持血管生成
    ?我们进行了凝胶重塑分析，并观察到MAF显示出更密集、更复杂的F-肌动蛋白网络（图 A），并且可以比 CAF 更大程度地收缩凝胶（图B）。在新鲜和冷冻保存的组织中，我们观察到 LM 的基质硬度显着增加（图C-D）。基质硬度与来自同一患者的样本中的COL-I、aSMA 和 p-MLC2 表达相关（图E-G）。
    ?基质硬化调节 EC 增殖、血管生成、血管生长和分支，为了研究这种联系，我们评估了 LM 中的脉管系统，并观察了基质硬度和 CD31 血管面积之间的相关性（图H）。当在凝胶内培养时，允许成纤维细胞重塑基质，MAFs 诱导 EC 发芽的程度显着高于CAFs（图I-K）。因此，MAF 支持伴随局部 ECM 重塑的细胞因子产生血管生成。
    4、肾素-血管紧张素系统抑制目标成纤维细胞
    ?对新鲜分离的 MAF 与肝源性成纤维细胞的 qPCR 分析显示 RAS 系统的所有关键成分（血管紧张素原[AGT]、肾素[REN]、血管紧张素转化酶[ACE]和AT-1[AGTR1]的表达显着增加）。此外，MAFs 表达的 AGT 和 AGTR1 水平显着高于CAFs（图L-O）。为了表征 RAS 靶向对 MAF 功能的影响，我们在用氯沙坦（一种AT-1阻滞剂）或卡托普利（一种ACE抑制剂）治疗后进行了凝胶收缩试验。在低浓度（氯沙坦为1mM，卡托普利为5mM）和高浓度（氯沙坦为10mM，卡托普利为 50mM）时，两者都显着降低了 MAF 凝胶收缩（图P-R）。
    5、RAS 抑制降低转移基质硬度并重塑微环境
    ?与无高血压组和非 RAS 治疗组2相比，接受抗 RAS 药物治疗的患者组织硬度显着降低（图A-B）。进一步评估（通过对同一患者组中的COL-1、aSMA 和 pMLC2 染色）是否可以通过 MAF 激活的下调来解释转移刚度的差异。虽然高血压与 pMLC2 染色的增加相关，但我们没有观察到对aSMA 和 COL-I 的影响（图C-H）。在所有组中，抗 RAS 治疗显示 MAF 激活和 ECM 沉积显着减少（图C-H）。抗RAS药物的作用独立于特定的 RAS 抑制治疗。观察到转移僵硬（不同条件±高血压±抗RAS药物）与COL-I、aSMA和p-MLC2表达之间呈正相关（图I-K），表明MAF激活水平有助于组织僵硬在LM。总之，接受抗 RAS 治疗的患者显示出低肌成纤维细胞/ECM 特征，这解释了转移硬化的减少。
    6、AT1R 信号转导通过 RhoA 介导 MAF 激活
    ?接下来，作者想确定 RAS 抑制如何导致 MAF 激活减少。体外用氯沙坦或卡托普利处理 MAF 表明 LOX 和 COL1A1 mRNA 表达降低（图A-B）。p-MLC2 在 RAS 抑制后也显着减少（图C-D）。氯沙坦和卡托普利治疗显着降低了 ARHGEF1 的酪氨酸磷酸化，并导致活性 RhoA 减少（图E-H）。类似地，ARHGEF1 的敲低导致 p-MLC2 减少，支持血管紧张素-ARHGEF1-RhoA 轴在 MAF 中的作用（图I-J）。总的来说，我们结果表明 RAS 通路抑制剂通过抑制 MAF 主动收缩（图K）以及减少胶原蛋白生成和交联来阻止基质硬化，从而改善肿瘤纤维化过程。
    7、RAS 抑制增加了贝伐单抗的抗血管生成作用
    ?基质硬度不受单独贝伐单抗治疗的影响（图A-B）。在 Bev-组中，与非 RAS 治疗的高血压患者和无高血压患者相比，抗 RAS 治疗导致组织硬度降低（图A，C）。类似地，在 Bev 组中，在抗 RAS 治疗的患者中也观察到了相同的基质硬度降低（所有p＜0.001）（图A，D）。此外，抗 RAS 治疗组的硬度降低与特定治疗无关。单独的贝伐单抗治疗不影响 LM 内的 COL-I、aSMA 和 p-MLC2。为了评估抗血管生成治疗（贝伐珠单抗治疗）和RAS 抑制对血管系统的综合影响，我们测量了一大群 CRC LM 中的血管密度。与 Bev-组相比，Bev+组的血管密度显着降低了48.7%± 8.2%。然而，与非RAS、Bev+治疗相比以及与所有 Bev-组。这与使用的 RAS 治疗类型无关。因此，抗 RAS 药物靶向组织硬度，从而影响贝伐单抗的疗效。
    8、通过 RAS 和血管生成抑制减少 EC 增殖
    ? EC 增殖随硬度增加而增加，VEGF 进一步诱导增殖，低硬度时 VEGF 效应最高（图A-C）。此外，我们分析了在不同密度的纤维蛋白原基质（刚度的代表）中存在或不存在 VEGF 的情况下 EC 发芽。EC发芽（芽的数量和长度）随密度增加。VEGF 导致在所有条件下进一步发芽，VEGF 在软基质中的作用更显着，如 EC 增殖的情况。
    ?为了了解抗 RAS 药物和贝伐单抗的组合如何影响转移灶内的 EC，我们量化了它们对 EC 增殖的影响。单独的贝伐单抗治疗导致 EC 增殖减少 56.1%±11.0%。由于转移僵硬与独立于治疗的转移内的 EC 增殖相关，我们评估了 RAS 抑制是否足以减少 EC 增殖。在未接受抗血管生成治疗的患者中，RAS 抑制并未显着降低 EC 增殖；然而，在接受贝伐单抗和抗 RAS 药物治疗的患者中，EC增殖进一步降低了 78.1%±9.2%）。
    9、RAS 和血管生成抑制改善血管完整性
    ?有趣的是，VEGF 和基质硬化都有效地导致血管通透性。为了进一步表征抗 RAS 药物对血管完整性的作用，我们通过对紧密连接蛋白 ZO-1（封闭小带1）进行免疫染色分析了它们对EC 连接稳定性的影响。虽然建议贝伐单抗治疗导致消除未成熟血管，但我们观察到贝伐单抗对 ZO-1 紧密连接没有变化（图A-B）。与之前在其他疾病模型中的发现一致，即增加基质刚度可增强内皮通透性，我们还观察到 ZO-1 覆盖率与 CRC LM 的组织硬度之间存在负相关，表明在更硬的 LM (图C)。在接受抗 RAS 药物治疗的 Bev-患者中，我们还观察到 EC 中 ZO-1 覆盖率的增加，表明单独的抗 RAS 足以改善内皮连接稳定性（图A，D）。然而，在联合治疗（Bev+和抗 RAS）中，对连接稳定性的影响大大增强（图A，E）。
    ? KLF2 是一种剪切应力响应转录因子，其表达随层流剪切应力增加，是灌注的标志。抗血管生成治疗没有改变内皮细胞中 KLF2 的表达（图F-G）。然而，KLF2 表达与组织刚度呈负相关，表明基质硬度增加会损害灌注（图H）。在未接受贝伐珠单抗治疗的患者中，KLF2 表达未因抗 RAS 治疗而改变（图F-I），但在抗 RAS 和贝伐单抗治疗的患者中显着更高（图F、J）。
    10、内皮细胞YAP/TAZ 是受 LM 基质硬度和VEGF 调节的中枢
    ?然后我们使用EC 核标记 ERG1 分析了患者样本中的 EC YAP/TAZ 激活状态。抗血管生成治疗导致 YAP/TAZ EC 硬度降低（图K，L），表明 VEGF 信号是 LM 中 EC 中 YAP/TAZ 易位所必需的。然而，与非高血压患者以及接受贝伐珠单抗和非 RAS 药物治疗的患者相比，贝伐珠单抗治疗同时停用 VEGF 的同时降低僵硬度降低了核 YAP/TAZ 强度（图K，N），与 RAS 抑制的类型无关。最相关的是，我们观察到接受 LM 切除术并在疾病过程中接受抗血管生成治疗并同时进行抗 RAS 治疗的患者的 OS 显着延长。 这通过多变量 Cox 回归分析得到证实（图O）。综上所述，抗血管生成治疗联合RAS抑制显着抑制内皮 YAP/TAZ 激活和转移性血管生成。
    ?研究优点：
    ①肿瘤受到其微环境的机械特性的影响。利用患者样本和原子力显微镜，我们发现肝转移瘤的组织硬度高于原发性结直肠肿瘤。高度活化的转移相关成纤维细胞增加了组织的硬度，从而增强了血管生成和抗血管生成治疗的抵抗力。
    ②针对肾素-血管紧张素系统的药物通常用于治疗高血压，可抑制成纤维细胞收缩和细胞外基质沉积，从而减少肝转移瘤硬化，并增加贝伐单抗的抗血管生成作用。
    ③接受贝伐单抗治疗的患者在同时接受肾素-血管紧张素抑制剂治疗时存活时间延长，这突显了调节治疗方案的机械微环境的重要性。
    ?研究局限性：
    ①对于接受贝伐单抗治疗的结直肠癌和肺癌患者，贝伐单抗治疗本身就能诱发高血压。在该研究中并未对与贝伐单抗无关的高血压及贝伐单抗导致的高血压进行区分。